rRNA配列を用いた魚種判別、系統樹解析

サンガーシーケンスのデータを開いて、データベースで相同性検索を行い、肉片の魚種を推定する。さらにシーケンスした配列を含めた魚類の系統樹を作成する。

番号	食品名
1	サーモン
2	コハダ
3	サバ
5	アーモンドフィッシュ
6	蒲焼さん太郎
8	ちくわ
10	サンマ
11	サーモン
12	ネコのえさ
13	おにぎり（たらこ）
14	めんたいこ
16	いわしチップス
17	ブリ

1．ウェブブラウザを開く。

2．Geneiousのインストールファイルをダウンロードする。下記のページの「Download…」ボタンをクリックします。(スクリーンショットは一部古くなっている箇所もあり、OSやバージョンがずれていることがあります。)

https://www.geneious.com/download/

3．「ファイルを保存する」で「OK」を押します。

4．ダウンロードが完了したらダウンロードしたファイルを開き、Geneiousのインストーラに従ってインストールを行います。

5．そのままGeneiousを起動します。

6．「Trial Later」をクリックします。

1．下記のzipデータをダウンロードし、アーカイブマネージャーで開いて、「展開」をクリックし、適当な場所にファイルを解凍する（OSによって操作は多少違います）。とりあえず使うのは各自担当したサンプルのフォワードとリバースのシーケンスデータですが、自分の番号のデータがない人は他のデータを使ってください。

http://suikou.fs.a.u-tokyo.ac.jp/yosh_data/2022jissyu/2022sanger.zip

(右クリックして「名前を付けて保存」を選ばないとChromeではダウンロードできません。)

2．Geneiousでシーケンスファイルを開く。「Sources」をLocalなど適当な場所を選択しておいて、「File」→「Import」→「From File…」をクリックし、先ほど解凍したシーケンスファイルを選択して、「Import」をクリックする。

3．拡大すると、サンガーシーケンスの波形を見ることが出来る。

4．綺麗に読めた部分だけ抜き出して、別ファイルに保存する。まずは綺麗に読めた部分をドラッグ＆ドロップで選択し、右クリックしてコピーを選択する。

5．リストの適当なところで右クリックして、Pasteを押す。

6．フォワードとリバースで抜きだした配列を選択し、アライメントを実行する。

7．自動で配列の向きを合わせてくれるように「Automatically determine direction (slower)」にチェックを入れておく。

8．下記のプライマー配列がコンセンサス配列の両端に出現するか確認してみる。

16SarL（フォワード）	CGCCTGTTTATCAAAAACAT
16SbrH（リバース）	CCGGTCTGAACTCAGATCACGT

9．Consensus配列をドラッグ＆ドロップで選択し、右クリックしてCopyする。

10．下記のNCBI BLASTのページを開いて、「nucleotide → nucleotide」（通称blastn）を開いて、コピーした配列をクエリーに張り付ける。Databaseにnr/ntが選択されていることを確認して、BLASTをクリックする。nr/ntはGenbankに登録された配列の冗長さを除去した(non-redundantな)データベースで、幅広い生物種・遺伝子が網羅的にバランスよく登録されていて、まずはここで配列を検索する研究者が多い。

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

11．そのほか、魚類のミトコンドリア専用のデータベースとして、東大岩崎研でメンテナンスされているMitoFishデータベースがある。こちらは2022年11月現在、3,492種の魚の完全長のミトコンドリアが登録されており、BLAST検索が可能である。NCBI NTデータベースと、MitoFishデータベース両方で検索して違いを比較してみる。

http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/

12．ミトコンドリアの配列をデータベースからダウンロードし、シーケンスデータとアライメントを行い、シーケンスした領域がどこだったのか確認する。

NCBI、MitoFishどちらも結果を適当にクリックしていると、ヒットした配列のAccession番号のリンクを見つけることが出来るはず。Accession番号を開くと、GenBankに登録されている配列をアノテーション付きで表示することが可能である。

13．シーケンスデータと相同性のある完全長ミトコンドリアの配列をGenBankで開き、GenBank形式でファイルに保存するを選んでダウンロードする。

14．Geneiousで「File」→「Import」→「From File…」をクリックし、先ほどダウンロードしたGenBankファイルを開く。

15．シーケンスデータと、インポートしたGenBankファイルを選択し、「Align/Assemble」→「Multiple Align…」をクリックする。「Automatically determine direction (slower)」にチェックを入れて「OK」を押す。

16．Alignment ViewでCtrl+Fを押すと、配列を検索する画面が開くので、下記のプライマーの配列を張り付けて検索してみる。もしヒットしない場合は、プライマーの配列が保存されていない可能性もあるため、適当に検索する配列を短くしてヒットするかどうかを見ていく。ヒットする配列は基本的には16S rRNAの中にあるはずである。

16SarL（フォワード）	CGCCTGTTTATCAAAAACAT
16SbrH（リバース）	CCGGTCTGAACTCAGATCACGT

17．プライマーの配列から何塩基くらい離れたところからシーケンスが開始されているか、シーケンスデータとリファレンス配列が不一致な場所があれば、波形が綺麗に読まれているかどうかを確認する。

自分の担当したサンプル番号とBLASTの結果を、Zoomのチャットに書き込んで提出する。

ミトコンドリア16S rRNAによる魚類の系統樹を作成し、魚類の中での系統関係を解析する。

1．サンガーシーケンスで得られたフォワードとリバースのコンセンサス配列を新しいレコードに保存しておく。

2．下記のファイルには46種の生物のミトコンドリア16S rRNA配列が含まれているのでダウンロードする。

http://suikou.fs.a.u-tokyo.ac.jp/yosh_data/2020jissyu/16S-46sp.fasta.zip

3．Geneiousの「File」→「Import」→「From File…」からダウンロードしたファイルを開く。その際、「Nucleotide sequences」→「Keep sequences separate」を選んでおく。

4．各自担当した魚肉の配列と、追加した46種の配列を全て選択して、「Align/Assemble」→「Multiple Align…」をクリックし、マルチプルアライメントを作成する。（しばらく時間がかかる。）

5．マルチプルアライメント結果を選択した状態で、「Tree」をクリックし、UPGMAによる系統樹を作成する。その際各分岐の確からしさをブートストラップ法によって求めるため、「Resample tree」にチェックを入れて「OK」を押す。

6．作成された系統樹には、大分類群から分類名が書かれているため、そのままでは見えづらいので、Tip Labelsを開いて、Max Charsを30→200などに変更して分類名を表示してみる。そうすると、「Chondrichthyes（軟骨魚綱）」と硬骨魚類の属する「Teleostomi（真口亜綱）」で分かれているのが見られるはず。