2019年水圏生物科学実験III

出典：http://ajan.ciceros.co

リボソームはRNAとタンパク質の複合体であり、原核生物の場合、大きく50Sと30Sのサブユニットに分かれる。30S複合体の中には16S rRNAが含まれる。

出典：https://www.quora.com/How-do-50s-and-30s-ribosomal-subunits-make-70s-ribosomes?no_redirect=1

16S rRNAは保存性の高いConserved Regionsと、変化の多いVariable Regionsが交互に出現する。

出典：https://biology.stackexchange.com/questions/54823/what-causes-the-variable-conserved-structure-in-the-16s-rrna-gene

rRNAはmRNAとは異なり、二次構造を取ることが知られている。

出典：https://www.nature.com/articles/nrmicro3330/figures/1

12S rRNAは真核生物のミトコンドリアにコードされている遺伝子で、16S rRNAに相同な遺伝子である。

出典：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5379257/figure/f1/

16S, 12Sの保存性の高い領域に設計したプライマーを使用している。具体的には次の配列を使用している。

名前	配列	生物種	増える長さ
ミトコンドリア16S一部 Forward (16SAR-L)	CGCCTGTTATCAAAAACAT	脊椎動物，節足動物，軟体動物等	600 bp程度
ミトコンドリア16S一部 Reverse (16SBR-H)	CCGGTCTGAACTCAGATCACGT	脊椎動物，節足動物，軟体動物等	600 bp程度
バクテリア16S全長 Forward (27F)	AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG	バクテリア全般	1.5 kbp程度
バクテリア16S全長 Reverse (1492R)	GGTTACCTTGTTACGACTT	バクテリア全般	1.5 kbp程度
ミトコンドリア12S全長 Forward	AHTTAYACATGCAAGTHTCM	魚類	1 kbp弱
ミトコンドリア12S全長 Reverse	YRCACYTTCCRGTACRCTTA	魚類	1 kbp弱
ミトコンドリア12S MiFish Forward (MiFish-U-F)	GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC	魚類	200 bp程度
ミトコンドリア12S MiFish Reverse (MiFish-U-R)	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	魚類	200 bp程度

東大新領域情報生命笠原先生の講義資料より

まずは2つの配列がどの程度似ているのかをスコアを付けることを考えてみる。

https://en.wikipedia.org/wiki/Smith%E2%80%93Waterman_algorithm

JST HPより

BLASTは、相同性検索（ホモロジーサーチ）を比較的高速に行うプログラムである。厳密な解を提供する Smith-Watermanアルゴリズムを少しヒューリスティックにすることで、完全な厳密解は与えないものの実用的には十分な精度を持ちつつ、 Smith-Watermanよりはるかに高速に検索を実現した。また、BLASTではペアワイズの相同性検索の結果に対して、偶然そのような配列の一致が起こる期待値e-valueを出力し、閾値以上でデータベースとヒットした結果を出力する。

データベース検索する場合、下記のようにデータベース側は100 Gbaseを超える場合もあり、非常に巨大である。しかし、その中で相同な配列というのは通常そんなに多くはない。

そこで、あらかじめwordサイズで指定した大きさで100%マッチする場所を高速に調べておき、その周辺のみ時間をかけて調べることで高速化している。

このwordサイズはNCBIのWEBサイトで公開されているBLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )などでは、デフォルトが28 bpと比較的大きめなので、シーケンス精度が悪い場合は注意する必要があるかもしれない。

BLASTでは、問い合わせ配列とデータベース配列の組み合わせから、次の5種類が用意されている。

プログラム名	query	db
blastn	DNA	DNA
blastp	protein	protein
blastx	DNA	protein	(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)
tblastn	protein	DNA	(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)
tblastx	DNA	DNA	(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)