2021-アガロースゲルのバンド定量

アガロースゲルの写真からDNA量を定量する

今回の実習で必要なコンピュータのスペックは、メモリ8GB以上、HDDの空き容量が50GBあるPCであれば十分です。もし十分なスペックのPCが手元にあれば、自分のPCで解析することを推奨します。

もし十分なスペックがない場合は、水圏生物工学研究室のPCを遠隔で使用することが可能です。

下記の4つのいずれかの環境を選択し、それぞれ事前準備を進めてください。

以下は「水圏生物工学研究室のLinux PCにログインして解析する」場合を想定して説明しますが、今回使用するソフトウェアはWindows版、Mac版、Linux版それぞれインストーラが存在するので、どのOSを使っても大丈夫です。

1.ウェブブラウザ(Firefox)を開く。

2. 今見ているこのページをFirefoxで開いておく。皆さんのPCとリモートデスクトップ先のLinuxの間では文字のコピー&ペーストが行えます。https://imagej.nih.gov/ij/download.html を開いて、自分の使用しているOSにあった“ImageJ bundled with Java”をダウンロードする。

3. ファイルマネージャーを開く。

4. zipファイルを解凍する。

5. ImageJを起動する。

6. 電気泳動写真をダウンロードする。

http://suikou.fs.a.u-tokyo.ac.jp/yosh_data/2021jissyu/2021gels.zip

7. 電気泳動写真をImageJで開く。(File → Open)

8. 1レーン目を四角形で囲む。

9. Analyze → Gels → Select First Laneをクリックして、1レーン目を登録する。

10. 1レーン目の四角をドラッグ&ドロップして2レーン目を囲む。

11. Analyze → Gels → Select Next Laneをクリックして、2レーン目を登録する。

12. 10-11を繰り返して必要なレーンを登録する。

13. Analyze → Gels → Plot Lanesをクリックして輝度の波形情報をプロットします。

14. 直線ツールを使って各ピークを区切る。Shiftを押しながら線を引くとまっすぐ引ける。

15. 魔法の杖ツールを選択して、各ピークの中をクリックしていくと各ピークの面積がResultsウィンドウに表示される。

16. Resultsウインドウを選択した状態で、「Edit」→「Copy」でResultsをコピーしてExcel等に張り付ける。使用したGene Ladder 100マーカーの分子量・濃度は下記の通り。

https://www.nippongene.com/siyaku/product/electrophoresis/tds/tds_gene-ladder-100.pdf

17. ImageJで定量した面積と、DNA量が相関しているか確認する。また、16S, 18S, 12Sそれぞれで「1st PCR産物」と「切り出し精製後」のバンドをImageJで定量し、切り出し精製の収率を計算する。(おそらく50%程度のはず)


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