Visium解析引継ぎ資料

解析フローとしては大きく以下の流れで行った。

Space Ranger(というよりかはSTAR)と互換性を保つようにGTFファイルを編集
Space Rangerのmkrefコマンドでインデックスを作成
Space Rangerのcountコマンドでリファレンスへのマッピングとカウント、および組織の検出
Web Summaryによる概要の確認
Loupe Browserによる解析
Seuratによる解析
その他下流解析

10X Genomicsによって提供されているヒトやマウス以外の非モデル生物のカスタムリファレンスを使用したい場合は、GTFファイルを編集し、STARとの互換性を保つようにする必要がある。

互換性を保つためには以下の２つの処理が必要（もしかしたら他にも必要かも）

GTFファイルの9列目のAttribute列にgene_idとtranscript_idが入っている必要がある。
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Before

# Predicted genes for sequence number 1 on both strands
# start gene g00001
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        gene    19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcript      19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001.t1;Parent=pfu_aug170726_10_00001
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcription_start_site        19      19      .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        exon    19      284     .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        start_codon     224     226     .       +       0       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  285     6779    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  6929    8036    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  8154    8308    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1

After

scaffold10|size694159   AUGUSTUS        gene    19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcript      19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001.t1;Parent=pfu_aug170726_10_00001; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcription_start_site        19      19      .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        exon    19      284     .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        start_codon     224     226     .       +       0       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  285     6779    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  6929    8036    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  8154    8308    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";

Space Rangerのmkrefコマンドを使用して、リファレンスのインデックスを作成する。

spaceranger mkref --genome=(インデックス名) --fasta=(リファレンスの
のFASTAファイル) --genes=(リファレンスのGTFファイル)

実際に使用したコマンドは以下の通り

spaceranger mkref --genome=akoya_ref_20211015 --fasta=raw/pfu_170726_scaffold.gapclosed.fasta --genes=raw/pfu_aug170726.modID_modified_20201020_filtered.gtf

ちなみにSpace Rangerのダウンロードは以下のリンク先から可能である。

Space Ranger Software Download

また最新版でない可能性があるが、伊藤がインストールしたSpace Rangerは/suikou/files/m208/ito.takumi/work/visium/space_ranger/spaceranger-1.0.0/bin/spaceranger にあるのでそれを使用してもよい。

Space Rangerのcountコマンドを用いて、組織検出、リードのマッピングとカウントを行った。

spaceranger count --id=(作成するディレクトリの名前) --transcriptome=(リファレンスインデックスのPATH) --fastqs=(シーケンスデータが格納されたディレクトリのPATH) --sample=(サンプル名、FASTQファイルの接頭辞？おそらくなくてもOK) --image=(組織切片の画像) --slide=(Visium SlideのID、Slideに記載されている) --area=(Slide上の切片を置いた位置) --localcores=(コア数) --localmem=(メモリ)

実際に使用したコマンドは以下のとおり

spaceranger count --id=mantle_20211015 --transcriptome=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/ref/akoya_ref_20211015/ --fastqs=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/mantle/input/ --sample=akoya_mantle --image=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/image/20210718155118_pinctada_mantle.tif --slide=V10T17-119 --area=A1 --localcores=8 --localmem=64

countコマンドの出力としてoutsディレクトリが作成され、以下のファイルおよびディレクトリがoutsディレクトリ内に作成される。

analysis → 下流解析の結果
cloupe.cloupe → Loupe Browserの入力ファイルとして使用
filtered_feature_bc_matrix →
filtered_feature_bc_matrix.h5
metrics_summary.csv
molecule_info.h5
possorted_genome_bam.bam
possorted_genome_bam.bam.bai
raw_feature_bc_matrix
raw_feature_bc_matrix.h5
spatial
web_summary.html → Visium実験のサマリーを表示するHTMLファイル

Web Summaryによる実験概要の確認

Space Rangerのcountコマンドの出力であるWeb Summaryをもとに実験概要の確認を行う。

①Alertの確認

②シーケンス情報の確認（スポット当たりのリード数が50000リード程度あれば十分なシーケンス量を確保できているといえる）

③マッピング情報の確認

③スポットの情報の確認

④サンプル情報の確認

またこれらをグラフで可視化したものや、簡易的なクラスタリング図などを「Analysis」タブから確認することもできる。

Loupe Browserを用いることでGUIベースで空間遺伝子発現解析の解析を行うことができる。各遺伝子の空間遺伝子発現分布の取得、組織のクラスタリング、UMAPの描画などが主な機能となる。ただしクラスタリングに関しては細かいパラメータの調整などが不可能であるため、CUIベースのSeuratで行うことを推奨する。一方各遺伝子の空間遺伝子発現分布の取得においてはどちらでもそこまで変わりはないためLoupe Browserで行った方が楽に思われる（伊藤の感想としては、色調のパラメータ調整がLegendの表示がLoupe Browserの方が楽と感じた）。

入力データとしてはSpace Rangerの出力ファイルである、cloupe.cloupe を使用する。

①「Categories」を選択することでクラスタリングを行う。(Spatialで組織クラスタリング結果図を、UMAPでUMAP図を表示する)