2021-アガロースゲルのバンド定量 [講義ノート]

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# アガロースゲルの写真からDNA量を定量する

## A. 使用するコンピュータについて

今回の実習で必要なコンピュータのスペックは、メモリ8GB以上、HDDの空き容量が50GBあるPCであれば十分です。もし十分なスペックのPCが手元にあれば、自分のPCで解析することを推奨します。

もし十分なスペックがない場合は、水圏生物工学研究室のPCを遠隔で使用することが可能です。

下記の4つのいずれかの環境を選択し、それぞれ事前準備を進めてください。

- [[自分のWindows PCで解析する]]

- [[自分のMacで解析する]]

- [[自分のWindows PCから水圏生物工学研究室のPCにログインして解析する|自分のWindows PCから水圏生物工学研究室のLinux PCにログインして解析する]]

- [[自分のMacから水圏生物工学研究室のPCにログインして解析する|自分のMacから水圏生物工学研究室のLinux PCにログインして解析する]]

以下は「水圏生物工学研究室のLinux PCにログインして解析する」場合を想定して説明しますが、今回使用するソフトウェアはWindows版、Mac版、Linux版それぞれインストーラが存在するので、どのOSを使っても大丈夫です。

## B. 参考ページ

https://www.iqb.u-tokyo.ac.jp/chem/IMCB-8ken-HP/Lab_Manuals/entori/2017/6/26_ImageJ_files/20170513_ImageJ%e3%81%ae%e4%bd%bf%e3%81%84%e6%96%b9.pdf

https://www.chem-agilent.com/appnote/applinote.php?pubno=5989-1086EN 本日行う内容を自動でより精度よく行う装置。

## C. ImageJのインストール

1．ウェブブラウザ（Firefox）を開く。
 
 {{:pasted:20211028-094956.png}}
 
2. 今見ているこのページをFirefoxで開いておく。皆さんのPCとリモートデスクトップ先のLinuxの間では文字のコピー＆ペーストが行えます。https://imagej.nih.gov/ij/download.html を開いて、自分の使用しているOSにあった"ImageJ bundled with Java"をダウンロードする。
 
 {{:pasted:20211028-095126.png}}
 
3. ファイルマネージャーを開く。
 
 {{:pasted:20211028-095248.png}}
 
4. zipファイルを解凍する。
 
 {{:pasted:20211028-095406.png}}
 
5. ImageJを起動する。
 
 {{:pasted:20211028-095840.png}}
 
6. 電気泳動写真をダウンロードする。
 
 http://suikou.fs.a.u-tokyo.ac.jp/yosh_data/2021jissyu/2021gels.zip
 
 
 
7. 電気泳動写真をImageJで開く。(File -> Open)
 
 {{:pasted:20211028-100053.png}}
 
8. 1レーン目を四角形で囲む。
 
 {{:pasted:20211028-100434.png}}
 
9. Analyze -> Gels -> Select First Laneをクリックして、1レーン目を登録する。
 
 {{:pasted:20211028-100354.png}}
 
10. 1レーン目の四角をドラッグ＆ドロップして2レーン目を囲む。
 
 {{:pasted:20211028-100758.png}}
 
11. Analyze -> Gels -> Select Next Laneをクリックして、2レーン目を登録する。
 
 {{:pasted:20211028-100923.png}}
 
12. 10-11を繰り返して必要なレーンを登録する。
 
13. Analyze -> Gels -> Plot Lanesをクリックして輝度の波形情報をプロットします。
 
 {{:pasted:20211028-101127.png}}
 
14. 直線ツールを使って各ピークを区切る。Shiftを押しながら線を引くとまっすぐ引ける。
 
 {{:pasted:20211028-102014.png}}
 
15. 魔法の杖ツールを選択して、各ピークの中をクリックしていくと各ピークの面積がResultsウィンドウに表示される。
 
 {{:pasted:20211028-102604.png}}
 
16. Resultsウインドウを選択した状態で、「Edit」→「Copy」でResultsをコピーしてExcel等に張り付ける。使用したGene Ladder 100マーカーの分子量・濃度は下記の通り。
 
 {{:pasted:20211028-102913.png}}
 
 https://www.nippongene.com/siyaku/product/electrophoresis/tds/tds_gene-ladder-100.pdf 
 
17. ImageJで定量した面積と、DNA量が相関しているか確認する。また、16S, 18S, 12Sそれぞれで「1st PCR産物」と「切り出し精製後」のバンドをImageJで定量し、切り出し精製の収率を計算する。（おそらく50%程度のはず）