# 2019年 水圏生物科学実験III

## リボソームについて

{{rrna.png}}

|  出典：http://ajan.ciceros.co|

リボソームはRNAとタンパク質の複合体であり、原核生物の場合、大きく50Sと30Sのサブユニットに分かれる。30S複合体の中には16S rRNAが含まれる。

{{rrna-30s.jpg}}

|  出典：https://www.quora.com/How-do-50s-and-30s-ribosomal-subunits-make-70s-ribosomes?no_redirect=1|

### 16S rRNA

16S rRNAは保存性の高いConserved Regionsと、変化の多いVariable Regionsが交互に出現する。

{{16srrna.jpg}}

|  出典：https://biology.stackexchange.com/questions/54823/what-causes-the-variable-conserved-structure-in-the-16s-rrna-gene|

rRNAはmRNAとは異なり、二次構造を取ることが知られている。

{{16srrna2d.jpg}}

|  出典：https://www.nature.com/articles/nrmicro3330/figures/1|

### 12S rRNAと16S rRNA

12S rRNAは真核生物のミトコンドリアにコードされている遺伝子で、16S rRNAに相同な遺伝子である。

{{12s-1.png}}
{{12s-2.png}}

|  出典：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5379257/figure/f1/|

### 学生実習で使用したプライマー

16S, 12Sの保存性の高い領域に設計したプライマーを使用している。具体的には次の配列を使用している。

|名前|配列|生物種|増える長さ|
|ミトコンドリア16S一部 Forward (16SAR-L)|CGCCTGTTATCAAAAACAT|脊椎動物，節足動物，軟体動物等|600 bp程度|
|ミトコンドリア16S一部 Reverse (16SBR-H)|CCGGTCTGAACTCAGATCACGT|脊椎動物，節足動物，軟体動物等|600 bp程度|
|バクテリア16S全長 Forward (27F)|AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG|バクテリア全般|1.5 kbp程度|
|バクテリア16S全長 Reverse (1492R)|GGTTACCTTGTTACGACTT|バクテリア全般|1.5 kbp程度|
|ミトコンドリア12S全長 Forward|AHTTAYACATGCAAGTHTCM|魚類|1 kbp弱|
|ミトコンドリア12S全長 Reverse|YRCACYTTCCRGTACRCTTA|魚類|1 kbp弱|
|ミトコンドリア12S MiFish Forward (MiFish-U-F)|GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC|魚類|200 bp程度|
|ミトコンドリア12S MiFish Reverse (MiFish-U-R)|CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG|魚類|200 bp程度|

## 配列の相同性検索について

### 相同性検索について 

[[http://mlab.cb.k.u-tokyo.ac.jp/~mkasa/upbsb2006/upbsb_shotgun_day1.pdf|東大 新領域 情報生命 笠原先生の講義資料]]より

まずは2つの配列がどの程度似ているのかをスコアを付けることを考えてみる。

{{aln1.png}}

{{aln2.png}}

{{aln3.png}}

{{aln4.png}}

### 最も似ているアライメントを効率よく求めるSmith-Watermanアルゴリズム

https://en.wikipedia.org/wiki/Smith%E2%80%93Waterman_algorithm

{{smith-waterman-algorithm-example-en.gif}}

### 相同性検索を高速に行うBLASTプログラム

[[http://www.jst.go.jp/nbdc/bird/minicourses/blast-tutorial.pdf|JST HPより]]
 
BLASTは、相同性検索（ホモ ロジーサーチ）を比較的高速に行うプログラムである。厳密な解を提供する Smith-Watermanアルゴリズムを少しヒューリスティックにすることで、完全な厳密解は与えないものの実用的には十分な精度を持ちつつ、 Smith-Watermanよりはるかに高速に検索を実現した。 また、BLASTではペアワイズの相同性検索の結果に対して、偶然そのような配列の一致が起こる期待値e-valueを出力し、閾値以上でデータベースとヒットした結果を出力する。 

### BLASTの高速化の概要

データベース検索する場合、下記のようにデータベース側は100 Gbaseを超える場合もあり、非常に巨大である。しかし、その中で相同な配列というのは通常そんなに多くはない。

{{2019学生実習.png}}

そこで、あらかじめwordサイズで指定した大きさで100%マッチする場所を高速に調べておき、その周辺のみ時間をかけて調べることで高速化している。

{{2019学生実習2.png}}

このwordサイズはNCBIのWEBサイトで公開されているBLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )などでは、デフォルトが28 bpと比較的大きめなので、シーケンス精度が悪い場合は注意する必要があるかもしれない。

### BLASTプログラムの種類

BLASTでは、問い合わせ配列とデータベース配列の組み合わせから、次の5種類が用意されている。 
|プログラム名|query|db||
|blastn|DNA|DNA||
|blastp|protein|protein||
|blastx|DNA|protein|(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)|
|tblastn|protein|DNA|(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)|
|tblastx|DNA|DNA|(DNAはアミノ酸に翻訳して比較)|

### Blastの結果についての説明

https://www.jaici.or.jp/stn/pdf/seqfaq.pdf

{{2017jissyu_2_.jpg}}

## NGSを使ったデータ解析について (2日目)

http://webpark1634.sakura.ne.jp/blog/2019/07/23/2019exp/