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--- visium解析引継ぎ資料 [2022/02/25 08:20] – 133.11.144.12
+++ visium解析引継ぎ資料 [Unknown date] (現在) – 削除 - 外部編集 (Unknown date) 127.0.0.1
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-====== Visium解析引継ぎ資料 ======
-解析フローとしては大きく以下の流れで行った。
-. Space Ranger(というよりかはSTAR)と互換性を保つようにGTFファイルを編集
-. Space Rangerのmkrefコマンドでインデックスを作成
-. Space Rangerのcountコマンドでリファレンスへのマッピングとカウント、および組織の検出
-. Web Summaryによる概要の確認
-. Loupe Browserによる解析
-. Seuratによる解析
-. その他下流解析
-===== GTFファイルの編集 =====
-X Genomicsによって提供されているヒトやマウス以外の非モデル生物のカスタムリファレンスを使用したい場合は、**GTFファイルを編集し、STARとの互換性を保つようにする必要がある。**
-互換性を保つためには以下の２つの処理が必要（もしかしたら他にも必要かも）
-. GTFファイルの9列目のAttribute列に''gene\_id''と''transcript\_id''が入っている必要がある。
-. コメント行を削除
-Before
-```
-# Predicted genes for sequence number 1 on both strands
-# start gene g00001
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        gene    19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcript      19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001.t1;Parent=pfu_aug170726_10_00001
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcription_start_site        19      19      .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        exon    19      284     .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        start_codon     224     226     .       +       0       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  285     6779    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  6929    8036    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  8154    8308    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1
-```
-After
-```
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        gene    19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcript      19      26628   0.11    +       .       ID=pfu_aug170726_10_00001.t1;Parent=pfu_aug170726_10_00001; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        transcription_start_site        19      19      .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        exon    19      284     .       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        start_codon     224     226     .       +       0       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  285     6779    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  6929    8036    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-scaffold10|size694159   AUGUSTUS        intron  8154    8308    1       +       .       Parent=pfu_aug170726_10_00001.t1; transcript_id "pfu_aug170726_10_00001.t1"; gene_id "pfu_aug170726_10_00001.t1";
-```
-===== インデックスの作成 =====
-Space Rangerのmkrefコマンドを使用して、リファレンスのインデックスを作成する。
-```
-spaceranger mkref --genome=(インデックス名) --fasta=(リファレンスの
-のFASTAファイル) --genes=(リファレンスのGTFファイル)
-```
-実際に使用したコマンドは以下の通り
-```
-spaceranger mkref --genome=akoya_ref_20211015 --fasta=raw/pfu_170726_scaffold.gapclosed.fasta --genes=raw/pfu_aug170726.modID_modified_20201020_filtered.gtf
-```
-ちなみにSpace Rangerのダウンロードは以下のリンク先から可能である。
-[[https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest | Space Ranger Software Download]]
-また最新版でない可能性があるが、伊藤がインストールしたSpace Rangerは/suikou/files/m208/ito.takumi/work/visium/space_ranger/spaceranger-1.0.0/bin/spaceranger にあるのでそれを使用してもよい。
-===== 組織検出およびマッピングとリードのカウント =====
-Space Rangerのcountコマンドを用いて、組織検出、リードのマッピングとカウントを行った。
-```
-spaceranger count --id=(作成するディレクトリの名前) --transcriptome=(リファレンスインデックスのPATH) --fastqs=(シーケンスデータが格納されたディレクトリのPATH) --sample=(サンプル名、FASTQファイルの接頭辞？おそらくなくてもOK) --image=(組織切片の画像) --slide=(Visium SlideのID、Slideに記載されている) --area=(Slide上の切片を置いた位置) --localcores=(コア数) --localmem=(メモリ)
-```
-実際に使用したコマンドは以下のとおり
-```
-spaceranger count --id=mantle_20211015 --transcriptome=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/ref/akoya_ref_20211015/ --fastqs=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/mantle/input/ --sample=akoya_mantle --image=/home/ito.takumi/work/pinctada/visium_spaceranger3/image/20210718155118_pinctada_mantle.tif --slide=V10T17-119 --area=A1 --localcores=8 --localmem=64
-```
-countコマンドの出力として''outs''ディレクトリが作成され、以下のファイルおよびディレクトリが''outs''ディレクトリ内に作成される。
-```
-analysis
-cloupe.cloupe
-filtered_feature_bc_matrix
-filtered_feature_bc_matrix.h5
-metrics_summary.csv
-molecule_info.h5
-possorted_genome_bam.bam
-possorted_genome_bam.bam.bai
-raw_feature_bc_matrix
-raw_feature_bc_matrix.h5
-spatial
-web_summary.html
-```