star_rsem

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star_rsem [2019/12/11 00:15] – [マッピング] 133.11.144.10star_rsem [Unknown date] (現在) – 削除 - 外部編集 (Unknown date) 127.0.0.1
行 1: 行 1:
-## anaconda install 
  
-<code> 
-[kijima.yusuke@m48 work]$ pwd 
-/home/kijima.yusuke/work 
-[kijima.yusuke@m48 work]$ cd work/tool/download/ 
-[kijima.yusuke@m48 work]$ wget https://repo.anaconda.com/archive/Anaconda3-2019.10-Linux-x86_64.sh 
-[kijima.yusuke@m48 work]$ chmod +x Anaconda3-2019.10-Linux-x86_64.sh 
-[kijima.yusuke@m48 work]$ ./Anaconda3-2019.10-Linux-x86_64.sh 
-[kijima.yusuke@m48 download]$ ./Anaconda3-2019.10-Linux-x86_64.sh 
- 
-Welcome to Anaconda3 2019.10 
- 
-In order to continue the installation process, please review the license 
-agreement. 
-Please, press ENTER to continue 
->>> 
-=================================== 
-Anaconda End User License Agreement 
-=================================== 
- 
-Copyright 2015, Anaconda, Inc. 
- 
-All rights reserved under the 3-clause BSD License: 
-... 
- 
-Do you accept the license terms? [yes|no] 
-[no] >>> yes 
- 
-Anaconda3 will now be installed into this location: 
-/home/kijima.yusuke/anaconda3 
- 
-  - Press ENTER to confirm the location 
-  - Press CTRL-C to abort the installation 
-  - Or specify a different location below 
- 
-[/home/kijima.yusuke/anaconda3] >>> /home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3 
-PREFIX=/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3 
-Unpacking payload ... 
-... 
-Thank you for installing Anaconda3! 
-</code> 
-一回サーバーから抜ける or bashrcを読み込むことでanaconda環境が完成。ユーザー名の左に(base)の文字が追加される。 
-<code> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 ~]$ 
-</code> 
- 
-## anaconda python3環境の作成 
-一応環境を隔離しておく。 
-<code> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda create -n anac_py37 python=3.7 anaconda 
-</code> 
-終わったら環境を起こす。 
-<code> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda activate anac_py37 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ #baseからanac_py37に環境が変わった 
-</code> 
- 
-## 各種ツールインストール 
-テキスト通り。 
-<code> 
-#trimmomatic 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda install -c bioconda trimmomatic 
- 
-#fastqc 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda install -c bioconda fastqc 
- 
-#STAR 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda install -c bioconda star 
- 
-#RSEM 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda install -c bioconda rsem 
- 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ rsem-calculate-expression --version 
-Current version: RSEM v1.3.1 
-</code> 
-テキストとは異なり、現在はconda経由でRSEM v1.3(最新)が落とせっるぽい。ばんざい 
-</code> 
- 
-## IGVのインストール 
-conda installでIGVの最新版が落とせないか一応調べる。 
-<code> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ conda search -c bioconda igv 
-Loading channels: done 
-# Name                       Version           Build  Channel 
-igv                           2.3.98               0  bioconda 
-igv                            2.4.6               0  bioconda 
-igv                            2.4.9               0  bioconda 
-igv                            2.4.9               1  bioconda 
-igv                           2.4.16               0  bioconda 
-igv                           2.4.17               0  bioconda 
-igv                            2.5.2               0  bioconda 
-</code> 
-最新版の2.6.1はbiocondaにはないっぽい。テキスト通りバイナリを落とす。 
-<code> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ mkdir rnaseq-training 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 work]$ cd rnaseq-training 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ mkdir tool 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ cd tool 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 tool]$ wget https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.7/IGV_Linux_2.7.2.zip 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 tool]$ unzip IGV_Linux_2.7.2.zip 
-</code> 
-最新が今(2019/12/9)は2.7.2みたいなのでそれを落とした。 
- 
-## リファレンスのダウンロード 
-<code> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 tool]$ cd ~/work/rnaseq-training 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ mkdir human 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ mkdir human/ref 
- 
-#Genome 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ wget -P ~/work/rnaseq-training/human/ref/ ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_32/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz 
- 
-#Annotation 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ wget -P ~/work/rnaseq-training/human/ref/ ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_32/gencode.v32.annotation.gtf.gz 
-</code> 
- 
-## シーケンスデータのダウンロード 
-URLのリストを作成。ここはテキストにないので好きにすると良い。逐次ダウンロードでも可。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ for i in $(seq 1 6); do for j in $(seq 1 2); do echo "ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/00${i}/SRR718955${i}/SRR718955${i}_${j}.fastq.gz" ;done; done > ~/work/rnaseq-training/human/data/SRR_Acc_list_forDownload.txt 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ cat ~/work/rnaseq-training/human/data/SRR_Acc_list_forDownload.txt 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/001/SRR7189551/SRR7189551_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/001/SRR7189551/SRR7189551_2.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/002/SRR7189552/SRR7189552_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/002/SRR7189552/SRR7189552_2.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/003/SRR7189553/SRR7189553_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/003/SRR7189553/SRR7189553_2.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/004/SRR7189554/SRR7189554_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/004/SRR7189554/SRR7189554_2.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/005/SRR7189555/SRR7189555_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/005/SRR7189555/SRR7189555_2.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/006/SRR7189556/SRR7189556_1.fastq.gz 
-ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR718/006/SRR7189556/SRR7189556_2.fastq.gz 
-</code> 
-wgetでダウンロード。アクセス切れたら中断されてしまうのでscreen使うなりリモートデスクトップにつなぐなりする。回線に絶対の自信があるなら何も考えなくても良い。それからforループで外部に連続的にアクセスするのはあまりよろしくないのでsleepを挟む。 
-<code bash> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ for i in $(cat ~/files/m48/kijima.yusuke/work/rnaseq-training/human/data/SRR_Acc_list_forDownload.txt); do wget -P ~/files/m48/kijima.yusuke/work/rnaseq-training/human/data/ $i; sleep 10;  done 
-</code> 
- 
-後々のためアクセッションIDのリストを作成。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ mkdir human/data 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ for i in SRR718955{1..6}; do echo $i; done > ~/work/rnaseq-training/human/data/SRR_Acc_list.txt 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ cat human/data/SRR_Acc_list.txt 
-SRR7189551 
-SRR7189552 
-SRR7189553 
-SRR7189554 
-SRR7189555 
-SRR7189556 
-</code> 
- 
-##Trimmomaticでアダプター除去+クオリティフィルタリング 
-テキスト通りanaconda3/share/trimmomaticからアダプター配列を取ってきたいが、このフォルダがなさそうなので探す。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ find /home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/ -name *trimmomatic* 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/share/trimmomatic 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/share/trimmomatic-0.39-1 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/share/trimmomatic-0.39-1/trimmomatic.jar 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/share/trimmomatic-0.39-1/trimmomatic 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/conda-meta/trimmomatic-0.39-1.json 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/envs/anac_py37/bin/trimmomatic 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1.tar.bz2 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/trimmomatic.jar 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/trimmomatic 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/info/recipe/0.32/trimmomatic.sh 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/info/recipe/0.33/trimmomatic.sh 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/info/recipe/trimmomatic.py 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/info/recipe/0.35/trimmomatic.sh 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/bin/trimmomatic 
-</code> 
-/home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/の中に入っているようだったので、ここのアダプター配列にリンクを貼る。 
-<code> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ ln -s /home/kijima.yusuke/work/tool/anaconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/adapters/TruSeq3-PE-2.fa human/data/ 
- 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 rnaseq-training]$ ls human/data/ 
-SRR_Acc_list.txt  SRR_Acc_list_forDownload.txt  TruSeq3-PE-2.fa  
-</code> 
-Trimmomaticを実行。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 data]$ for id in `cat SRR_Acc_list.txt`;do trimmomatic PE -threads 8 -phred33 -trimlog trimlog_${id}.txt -summary summari_${id}.txt ${id}_1.fastq.gz ${id}_2.fastq.gz ${id}_trim_pair_1.fastq.gz ${id}_trim_unpair_1.fastq.gz ${id}_trim_pair_2.fastq.gz ${id}_trim_unpair_2.fastq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50; done 
-</code> 
-終わったらsummrayを見てみる。 
-<code bash> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 data]$ cat summary_SRR7189551.txt 
-Input Read Pairs: 30499473 
-Both Surviving Reads: 30152544 
-Both Surviving Read Percent: 98.86 
-Forward Only Surviving Reads: 318460 
-Forward Only Surviving Read Percent: 1.04 
-Reverse Only Surviving Reads: 25447 
-Reverse Only Surviving Read Percent: 0.08 
-Dropped Reads: 3022 
-Dropped Read Percent: 0.01 
-</code> 
-テキストと完全一致。すごい。 
- 
-##Fastqcでクオリティチェック 
-テキスト通り。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 data]$ for id in `cat SRR_Acc_list.txt`; do fastqc -t 12 --nogroup -o fastqc -f fastq ${id}_trim_pair_1.fastq.gz ${id}_trim_pair_2.fastq.gz; done 
-</code> 
-結果は確認しておきましょう。 
- 
-##STARでマッピング 
-いよいよマッピング。まずはSTAR用のリファレンス作成から。 
-###リファレンス作成 
-gunzipファイルを解凍する。テキスト通りgtfは少し編集する。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 data]$ cd ../ref/ 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 ref]$ ls 
-GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz  gencode.v32.annotation.gtf.gz 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 ref]$ gunzip GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 ref]$ zcat gencode.v32.annotation.gtf.gz | grep -v _PAR_Y > gencode.v32.annotation.gtf 
-</code> 
-リファレンス作成。オプションの意味はテキスト読んでください。 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 ref]$ mkdir star_rsem 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 ref]$ nohup STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir star_rsem --runThreadN 12 --sjdbOverhang 99 --genomeFastaFiles GRCh38.primary_assembly.genome.fa --sjdbGTFfile gencode.v32.annotation.gtf & 
-</code> 
- 
-###マッピング 
-やるだけ 
-<code bash> 
-(anac_py37) [kijima.yusuke@m48 data]$ for id in `cat SRR_Acc_list.txt`; do mkdir ${id}; STAR --genomeDir ../ref/star_rsem/ --runThreadN 12 --outFileNamePrefix ${id}/ --quantMode TranscriptomeSAM --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --readFilesIn ${id}_trim_pair_1.fastq.gz ${id}_trim_pair_2.fastq.gz --readFilesCommand gunzip -c; done 
-</code> 
-結果を確認。 
-<code bash> 
-(base) [kijima.yusuke@m48 data]$ cat SRR7189551/Log.final.out 
-                          Number of input reads | 30152544 
-                      Average input read length | 199 
-                                    UNIQUE READS: 
-                   Uniquely mapped reads number | 28568001 
-                        Uniquely mapped reads % | 94.74% 
-                          Average mapped length | 199.28 
-                          ... 
-                             MULTI-MAPPING READS: 
-        Number of reads mapped to multiple loci | 1355491 
-             % of reads mapped to multiple loci | 4.50% 
-        Number of reads mapped to too many loci | 14845 
-             % of reads mapped to too many loci | 0.05%             
-</code> 
-マッピング率がテキストのバージョンよりわずかに向上していた。              
  • star_rsem.1576023333.txt.gz
  • 最終更新: 2019/12/11 00:15
  • by 133.11.144.10